A liquor cerebrospinalis vizsgálata a neurológiai klinikai diagnosztika fontos módszere. A neurológiai diagnosztikában az elmúlt másfél évtized alatt jelentős fejlődés történt. A modern képalkotó eljárások (CT, MRI, DSA, SPECT, PET) és az elektrofiziológiai módszerek (EEG, EMG, kiváltott válaszok) mellett sem szorultak háttérbe a klinikai liquordiagnosztikai vizsgálatok. Nemzetközi viszonylatban is többféle laboratóriumi módszert alkalmaznak a liquor cerebrospinalis vizsgálatára, de referens módszer nincs a liquor analízisére. Ezért tartottuk szükségesnek, hogy a liquor cerebrospinalis preanalitikai kezelésére ajánlást tegyünk, a rutin liquordiagnosztikai vizsgálatok mellett részletesebben szóljunk a mennyiségi és minőségi liquorfehérje analízisről. Munkánkban kiemeltük a sclerosis multiplexet (SM), ahol nemzetközileg jól definiált liquor vizsgálati eljárások ismertek. A mai napig nincs azonban az SM-et bizonyító liquorlelet. Célszerű ezért a lehető legtöbb, a diagnózis valószínűségét erősítő, a terápiás beavatkozások megválasztását segítő vagy a betegség prognózisára utaló adat nyerése.
The examinations of the cerebrospinal fluid (CSF) are very important in the cases of the neurological diagnostical investigations. Although neurological diagnostics are modified in a number of cases in the years past, in spite of the development of neuroimagine techniques (CT, MRI, DSA, SPECT, PET) and (EEG, EMG) the investigations of the cerebrospinal fluid did not thrust into the background. There are several investigations of the CSF of world-wide reputation, but the consensus reports were made in a few cases of the neurological diseases. We consider it necessary, that put forward a proposal for preanalitical processes of the CSF, and besides the routin liquordiagnostic investigations we have to speak about the quantitative and qualitative protein analyses of the CSF. Our aim is to report on methods for CSF examinations performed by us concerning multiple sclerosis with regard to the examinations suggested by the Charcot Foundation (1). In the course of CSF analysis it is important to discriminate between the immunoglobulins of normal amount, those synthesized locally and those penetrating into the damaged blood-CSF barrier. Normally a parallel assay of CSF and serum specimens is carried out in the course of quantitative and qualitative protein analysis. In 110 patients with clinical multiple sclerosis we determined the albumin and the immunglobulin classes IgG, IgA, IgM using laeser nephelometry. An elevated IgG index was found 75%, which refers to a local IgG synthesis and it might be a proof of the humoral immune response. The albumin quotient, which can be proper for the examination of the integrity of the blood-CSF barrier, was within the reference range. Qualitative protein analysis was performed by means of electrophoresis on agarose-gel and isoelectric focusing. By using agarose-gel electrophoresis oligoclonal gammopathy was found in 56% in contrast to 88% by using isoelectric focusing. Comparing the two kinds of qualitative protein analyses isoelectric focusing was found to be more sensitive for the detection of oligoclonal bands, wich is also supported by literature (2,4,5,6,8).
A hazai liquordiagnosztika művelői közül kiemelkedik Pándy Kálmán (1868-1948), nevét az általa kidolgozott speciális liquorvizsgálat tette nemzetközileg ismertté. Diagnosztikai módszereit magyar nyelven először Endersz Frigyes kórházi főorvos foglalta össze 1935-ben. Láng Sándor egyetemi docens a Budapesti Orvostudományi Egyetem Idegklinika laboratóriumában szerzett tapasztalatait 1965-ben tette közzé "Gyakorlati liquordiagnosztika" című művében. Értékes tevékenységet végzett Kerényi László a liquorfehérje analízis területén. Szántó József, Barakonyi István és Nikl József 1993-ban publikálták a "Liquor citodiagnosztika a klinikai gyakorlatban" című kiadványukat, amely hiánypótló műnek bizonyult a hazai szakirodalomban. Legutóbb 1996-ban megjelent "Liquordiagnosztika" című könyv (2) a liquoranalízis területén 1988-1995-ig rendelkezésre álló klinikai és kísérletes adatok ismertetését vállalta fel. A liquorkeringésről, a liquortermelésről és annak kóros változásairól ismereteink napról-napra újulnak (24).
A leggyakoribb mintavételi forma a lumbalpunkció. Liquor minta nyerése történhet még cysternapunkcióval, kamrapunkcióval (ma már diagnosztikus célzattal nem alkalmazzuk), kamradrainnel vagy spinaldrainnel. Ismert tény, hogy a mintavétel helyétől függően változik a liquor cerebrospinalis összetétele (összfehérje, sejtszám stb.). A lumbalpunkciót diagnosztikus, terápiás célzattal végezhetik, illetve aneszteziológiai beavatkozás során jöhet szóba (pl. fájdalomcsillapítás).
A modern diagnosztikai képalkotó eljárások mellett a lumbalpunkció főbb indikációs területei a központi idegrendszer gyulladásos folyamatai és demyelinisatios kórképek. Subarachnoidalis vérzésnél, ha a CT negatív, de a klinikai tünettan alapján fennáll a vérzés lehetősége, a mintavételt a diagnózis pontosítása végett el kell végezni. Ilyen esetekben hasznos segítséget nyújt számunkra a liquor direkt spektrofotometriás vizsgálata (21).
A punkciót végző és az analízisért felelős orvos egyaránt.
Mint minden klinikai diagnosztikai laboratóriumi vizsgálatnál, itt is nagyon fontos a preanalitikai folyamat. A beteg előkészítése, azonosítása, a beavatkozásba való beleegyezési nyilatkozat aláíratása és természetesen a beavatkozás veszélyeire való figyelmeztetés a lumbalpunkciót végző kolléga feladata. A liquor cerebrospinalis minta nyerésekor párhuzamosan, egyidőben vérvétel is szükséges. A mintavétel frakciókban történik. Véres liquor esetén 4-5 frakció, víztiszta liquor esetén 2 cső, frakciónként 2-2 ml szükséges. A kémcsöveket a mintavétel sorrendjében be kell számozni. A mintát frissen, testmelegen kell rutin vizsgálatok céljából az analízist végző laboratóriumba szállítani, vagy centrifugált, (8-10000 rpm-en, 15 percig) fagyasztott formában, egyidőben vett vérből nyert szérummal együtt a speciális vizsgálatokat végző laboratóriumba juttatni. A minta tárolása -80 °C-on történik.
A liquor cerebrospinalis vizsgálata számos megbetegedésnél fontos diagnosztikai felvilágosítást nyújt. Elsősorban azok a folyamatok vezetnek liquor elváltozásokhoz, melyek elérik a külső vagy belső liquorfelszínt vagy a liquortérben zajlanak. A liquordiagnosztikai vizsgálatok rutin vizsgálatokból (Sangurteszt, vvt- és fehérvérsejtszám meghatározás, összfehérje-, cukor-, laktát-, ionmeghatározás, spektrofotometriás vizsgálat, luesvizsgálat) mennyiségi és minőségi fehérjeanalízisből, valamint szükség esetén mikrobiológiai vizsgálatokból állnak. Véres liquor esetén első lépésként tisztázni kell a vér eredetét. A vér lehet arteficiális vagy patológiás eredetű, elkülönítésük az 1. táblázat segítségével lehetséges.
|
1. táblázat
|
Makroszkópos értékeléssel lehet a minta víztiszta, zavaros, xanthochrom vagy véres.
Sangur teszt alkalmas a szemmel nem látható vér kimutatására, az arteficiális vérzés kizárására (12).
Sejtszámlálás Fuchs-Rosenthal kamrában történik, gyakorlott szemmel natív liquorból párhuzamosan vvt- és fehérvérsejt számlálás minden egyes frakcióban külön-külön. Kisebb gyakorlat esetén a vvt-k ecetsavval történő lizálása után csak a fehérvérsejtek láthatók a Fuchs-Rosenthal kamrában.
Cytológiai vizsgálat során ülepítjük a sejteket a hagyományos Sayk-féle ülepítő kamrával vagy modern cytocentrifugával. Az ülepítést vérképhez hasonlóan festjük és fénymikroszkóp segítségével minőségileg értékeljük.
Összfehérjemérés számos módszerrel lehetséges (fehérjekicsapásos módszerek, festékkötésen alapuló reakciók, zavarosság mérésen alapuló módszerek stb.)
Spektrofotometriás mérés a liquorban levő haemoglobin származékok (oxi-haemoglobin és bilirubin) kimutatására alkalmas (21 ).
Luesviszgálat (VDLR, TPHA stb.)
Ma már nem elégedhetünk meg csak az összfehérje méréssel a liquordiagnosztikai vizsgálatok során. Közvetlen a betegágy mellett elvégzett Pándy reakciót (14) (óraüvegbe helyezett telített carbolsavas oldathoz néhány csepp liquort adunk) csak tájékozódás jelleggel végezzük. Opalescenciát okozhat a fokozott globin tartalom, vér, baktérium stb. A maga korában nagyon előremutatóak volt a dementia paralytica progressivás betegekkel kapcsolatos megfigyelései (7). Nemrégiben jelent meg munkásságát joggal méltató közlemény (20). A régebben használt Esbach, Nogouchi, Nonne-Apelt, Takata-Ara, Lange reakciók ma már nem nyújtanak elegendő felvilágosítást a liquor cerebro~spinalis kóros mivoltáról.
Ma is elterjedten használt Mancini-féle radiális immundiffúzió alkalmas az albumin és az IgG mennyiségi meghatározására liquorban és szérumban egyaránt. Zavarosságmérésen alapuló módszerek közül leggyakrabban használt turbidimetriás és nefelometriás méréseknél pontosabb mérést tesz lehetővé a liquorfehérjék analízisekor a nefelometriás mérés (17). Történhet még a liquor cerebrospinalisban a fehérjék mennyiségi meghatározása ELISA-val és RIA-val is. Lényeg, hogy ezek metodikafüggő meghatározások, és a vizsgálatokat végző laboratóriumnak saját referens értékkel kell rendelkeznie.
Bármelyik mennyiségi fehérjeanalízist végezzük két fontos index tükrében kapunk felvilágosítást a mintánkról. Az egyik ilyen fontos index az albuminhányados (liquor-albumin/szérum-albumin), amely egy dimenzió nélküli grádiens- és korfüggő hányados, és a vér-liqour-gát integritásának vizsgálatára alkalmas. A lumbalis liquor első 10 ml-ében 15 év alatt 5x10-3, 16-40 év között 6,5x10-3, 40-60 év között 8x10-3, 60 éven túl 8-9x10-3 (3, 16). A másik fontos index a Link-index, vagy IgG-index (illetve A és M immunglobulinok mérésekor IgA-index és IgM-index), melyet úgy kapunk meg, hogy a liquor-IgG/szérum IgG hányadost osztjuk az albuminhányadossal. Ez szintén egy dimenzió nélküli hányados, amely metodikafüggő és az intrathecalis immunglobulin szintézisről nyújt felvilágosítást.
A liquor cerebrospinalis minőségi fehérjeanalízise alatt elektroforézises vizsgálatot értünk. Mindig párhuzamosan liquort és szérumot futtatunk elektromos térben, a futtató közeg lehet agarose, poliakrilamid-gél (PAG), cellulose-acetat-fólia stb. Az elválasztott frakciók megjelenítése történhet valamilyen antitesttel (immunelfo), Coomassi Blue-val, vagy a fehérje frakciók legérzékenyebben ezüstfestéssel detektálhatók (10). A liquor cerebrospinalist mindig natívan, míg a szérumot általában hígított formában visszük fel a mintafelvivővel. A normális fehérje eloszlás mellett leggyakrabban a következő fehérje eloszlási képeket kapjuk: keverék típusú ferogram (ezüstfestéssel történt előhívás esetén nevezzük ferogramnak), diffuse g-szaporulat, monoclonalis gammopathia, oligoclonalis gammopathia (OGP) illetve egyéb fehérjefrakciók emelkedését vagy csökkenését láthatjuk. Keverék típusú ferogramnak diagnosztikus értéke vér-liquor-gát zavara esetén van, monoclonalis gammopathia esetén egyetlen extracsík figyelhető meg a szérum g-tartományban, pl. Waldenström makroglobulinaemiában. Oligoclonalis gammopathia látható a liquor g-tartományban, ha a központi idegrendszerben valamilyen humoralis immunválasz beindul, melynek eredményeképpen intrathecalisan immunglobulinok képződnek, pl. meningitis, encephalitis, sclerosis multiplex. Az előző két példa esetén gyógyulást követően az oligoclonalitás eltűnik, addig sclerosis multiplexben a betegre specifikusan, mint az ujjlenyomat jellemző az oligoclonalis csíkok jelenléte, függetlenül a betegség stádiumától illetve a meglévő neurológiai tünetektől. Legújabban az oligoclonalitás kimutatására kétdimenziós elektroforézist alkalmazzuk, ahol előbb a fehérjefrakciókat nagy feszültségen elektroforetizáljuk és a futtató közegben egy pH-grádienst létrehozó anyagot (poliamino-karbonsavak vegyülete) teszünk. Így a fehérjék nemcsak az elektromos térben vándorolnak töltésüknek megfelelően, hanem izoelektromos pontjuknak megfelelően el is választódnak.
A klinikai liquordiagnosztikai vizsgálatok az elmúlt évtizedek során nagy fejlődésen mentek keresztül, de sajnos a mai napig nincs nemzetközileg elfogadott referens módszer sem az összfehérje sem a mennyiségi és minőségi fehérjeanalízis terén. A külső minőségellenőrző programokban egyes vizsgálati módszerek jelen vannak (16), mint pl. hazai viszonylatban a QualiCont keretén belül a liquor összfehérje meghatározás és a mennyiségi liquor fehérje analízis. Nemzetközi szinten az INSTAND (összfehérje meghatározás, albuminhányados, mennyiségi és minőségi fehérjeanalízis) és a Labquality (összfehérje meghatározás, albuminhányados, IgG-index) által nyújtott minőségellenőrző programokban szerepelnek liquordiagnosztikai vizsgálatok.
A neurológiai kórképek közül a sclerosis multiplex betegség diagnózisának felállítása céljából született egy nemzetközileg elfogadott ajánlás a liquordiagnosztikai vizsgálatokat illetően. 1994-ben 12 európai liquordiagnosztikai centrum egy "consensus report" (1) keretében megfogalmazta a sclerosis muliplex diagnózis felállításához szükségeses esszenciális, kiegészítő és választható teszteket.
Esszenciális tesztként az izoelektromos fókuszálást (IEF) jelölték meg az oligoclonalis gammopathia kimutatására, kiegészítő tesztként javasolják a vér-liquor-gát integritásának vizsgálatát, az IgG-index meghatározást és a liquor sejtszám mérését. Választható tesztek az IgM meghatározás, az IgA meghatározása, a szabad kappa-és lambda könnyűláncok kimutatása.
Klinikánkon a nemzetközi ajánlásoknak megfelelően végezzük a liquordiagnosztikai vizsgálatokat. A liquor cerebrospinalis mennyiségi analízisekor laser nephelometriával meghatározzuk a szérumban és a liquorban az összfehérjén kívül az albumint, a IgG, IgA és IgM immunglobulinokat. Ha az albuminhányados a referens tartományon kívül van, akkor a vér-liquor-gát zavara áll fenn és akkor az IgG-index nem alkalmas önmagában az intrathecalis IgG szintézis megítélésére. Mindenképpen szükséges az oligoclonalitást igazoló minőségi fehérjeanalízis elvégzése.
Az utóbbi öt évben, Poser (15) kritérium szerint definiált 110 sclerosis multiplexes betegnél végzett vizsgálataink szerint az albuminhányados átlagértéke 6.07x10-3 volt, ami hasonló a nemzetközi irodalmi adatokhoz (2,4,5,22,23).
Az IgG-index emelkedése egy lehetőség a humorális immunválasz bizonyítására SM-ben. Eredményeink azt mutatták, hogy 75%-ban volt emelkedett az IgG-index. Ez megegyezik az irodalomban ismert adatokkal, miszerint SM-es betegek 70-90%-ában található IgG localis szintézis a liquorban.
Az IgM mennyiségi meghatározása liquorban, az IgM-index kiszámítása választható teszt az SM diagnózisában. Vizsgálataink során 38%-ban találtunk emelkedett IgM-indexet SM-es betegeknél. Kaiser (8), Sharief és mtsa ( 18) és Sindic és mtsai (19) intrathecalis IgM-termelést találtak -technikától függően- az SM-es betegek 30-60%-ában. Kevésbé értékes információ az SM diagnózisában, klinikai jelentősége abban van, hogy a betegség progressziójával az intrathecalis IgM értéke csökken, míg a kórkép korai szakaszában gyakrabban mutat emelkedett értéket.
Az IgA analízise is választható teszt, azonban mind mennyiségi, mind minőségi technikákkal végzett vizsgálatok kisértékűek a laboratóriumi vonatkozásban határozott SM-ben. A humorális immunválasz igazolására egyik lehetőség az oligoclonalis csíkok (OGPS) kimutatása a liquorban.
Agarose-gél elektroforézissel 61%-ban találtunk oligoclonalis gammopathiát és 9%-ban diffuse g-szaporulatot. Kerényi és mtsai 1975-ben SM-es betegek 70-90%-ában mutatott ki szubfrakcionált g-típusú ferrogramot a liquorban (11). E technikának érzékeny pontja az egyenletes hűtés, ami szükséges a szubfrakciók szétválásához, valószínűleg ennek a hiányának tudható be, hogy kilenc százalékban találtunk diffuse g-szaporulatot. Az oligoclonalis csíkok igazolása legérzékenyebben izoelektromos fókuszálással detektálhatók, a Charcot-alapítvány (1) esszenciális tesztként jelöli meg az SM liquordiagnosztikájában.
Valamennyi SM-es betegnél végeztünk IEF-t és 91%-ban találtunk a liquorban oligoclonalis IgG-t. Hasonló adatokat talált Mehta és mtsa (13). Chu és mtsai (6) 95%-ban mutattak ki oligoclonalitást sclerosis multiplexes betegek liquorában. Kilenc százalékban nem igazolódott OGP az izoelektromos fókuszálással sem. Ez annak tudható be, hogy első attackos SM-es betegekről van szó és a betegség korai szakaszában végzett lumbalpunkció eredménye negatív liquorlelet.
Összehasonlítva az agarose-gél elektroforézist és az IEF-t saját anyagunkban, azt tapasztaltuk, hogy az izoelektromos fókuszálással sokkal érzékenyebben detektálhatók az oligoclonalis csíkok, amit az irodalom is alátámaszt (9,18). Az IEF fokozott érzékenységű technika, rutinszerűen megkülönbözteti az oligoclonalis csíkokat a definitív SM-es betegek 90%-ban, a valószínű SM-es betegek 40-60%-ban és lehetséges SM-ben 20-30%-ban (2,4,5,6,8). Természetesen számos egyéb anyag vizsgálata történhet és kell, hogy megtörténjen a liquor cerebrospinalisból annak érdekében, hogy a különböző neurológiai kórképek diagnózisának felállítása biztonsággal megtörténhessen és laboratóriumilag is alátámasztható legyen.
A szerzők köszönetet mondanak a Szegedi Tudományegyetem Neurológiai Klinika Liquordiagnosztikai Laboratóriuma szakasszisztenseinek (Nagy Lászlóné, Szűcs Péterné) a liquordiagnosztikai laboratóriumban végzett áldozatkész munkájukért.
Andersson M, Alvarez-Cermeno J, Bernardi G, et al.: Cerebrospinal fluid in the diagnosis of multiple sclerosis: a consensus report
J Neurol NeurosurgPsychiatry 1994; 57: 897-902
Bencsik K, Klivényi P, Vécsei L.: Liquordiagnosztika Springer Hungarica Budapest 1996;
Blennow K, Fredmann P, Wallin A, et al.: Protein analysis in cerebrospinal fluid Eur
Neurology 1993 (a); 33: 126-128
Blennow K, Fredmann P, Wallin A, et al.: Protein analysis in cerebrospinal fluid Eur
Neurology 1993 (b); 33: 129-133
Blennow K, Fredmann P, Wallin A, et al.: Protein analysis in cerebrospinal fluid
Eur Neurology 1993 (c); 33: l34-142
Chu AB, Sever JL, Madden DL, et al.: Oligoclonal IgG bands in cerebrospinal fluid in various neurological diseases Ann Neurology 1983; 13: 434-439
Fabinyi R.: A Pándy-féle carbol-próba diagnosztikai értéke a liquor cerebrospinalis vizsgálatban
Orv Hetil 1917; 16: 219-220
Kaiser R.: Affinity immunoblotting: rapid and sensitive detection of oligoclonal IgG, IgA and IgM in unconcentrated CSF by agarose isoelectric focusing
J Neurol Sci 1991; 103: 216-225
Keir G, Luxton RW, Thompson EJ.: Isoelectric focusing of cerebrospinal fluid immunglobulin G: an annotated update Ann Clin Biochem 1990; 27: 436-443
Kerényi L, Gallyas F.: A highly sensitive method for demonstrating proteins in electrophoretic, immunelectrophoretic and immuno-diffusion preparationts Clin Chem Acta 1972; 38: 665-667
Kerényi L, Hegedűs K, Pálffy G.: Characteristic gammaglobulin subfractions of native CSF in multiple sclerosis
Brain Res 1975; 87: 123-125 12
Kerényi L, Szirmai I, et al.: Sangur-teszt: gyors módszer a liquor vörösvértest és hemoglobin tartalmának kimutatására Ideggyógy Szle 1979; 32: 328
Mehta PD, Patrick BA.: Detection of oligoclonal bands in unconcentrated CSF: Isoelectric focusing and silver staining Neurology 1983; 33: 1365-68
Pándy K.: A cerebrospinalis folyadék vizsgálatának újabb módjai
Orv Hetil 1910; 4: 7273
Poser CM, Paty DW, Scheinberg L, et al.: New diagnostic criteria for multiple sclerosis: guidelines for research protocols
Ann Neurol 1983; 13: 227-231
Reiber H.: External quality assessment in clincal neurochemistry: survay of analysis for cerebrospinal fluid (CSF) proteins based on CSF/serum quotients
Clin Chem 1995; 41: 256-63
Reiber H, Felgenhauer K.: Protein transfer at the blood cerebrospinal fluid barrier and the quantitation of the humoral immune response within the central nervous system
Clin Chim Acta 1987; 163: 319-328
Sharief MK, Thompson EJ.: Distribution of cerebrospinal fluid oligoclonal IgM bands in neurological diseases: a comparison between agarose electrophoresis and isoelectric focusing
J Neurol Sci 1992; 109: 83-87
Sindic CJM, Monteyne P, Laterre EC.: Occurrence of oligoclonal IgM bands in the cerebrospinal fluid of neurological patients: an immunoaffinity-mediated capillary blot study
J Neurol Sci 1994; 124: 215-219
Szilárd J.: Pándy Kálmán
Klin Kísérl Lab Med 1999; 26: 194-197
Szirmai I, Kreka L.: A liquorvizsgálat jelentősége az akut neurológiában
Orvosképzés 1988; 63: 339-350
Tibbling G, Link H, Öhman S.: Principles of albumin and IgG analyses in neurological disorders I. Establishment of reference values
Scand J Clin Lab Invest 1977; 37: 385-390
Tourtelotte WW, Ma BI.: Multiple sclerosis: The blood-brain barrier and the measurement of de novo central nervous system IgG synthesis
Neurology 1978; 28: 76-83
Weller RO.: Pathology of cerebrospinal fluid and interstitial fluid of the CNS: Significance for Alzheimer disease, prion disorders and multiple sclerosis
J Neuropath Exp Neurology 1998; 57: 885-894