The laboratory diagnostics of anti-phospholipid syndrome (APS) with special reference to the detection of lupus anticoagulant is reviewed. The clinical features of APS and the mechanisms leading to APS are summarized. The detection of anti-phospholipid antibodies and/or lupus anticoagulant are the basic criteria for the laboratory diagnosis of APS. The diagnosis of lupus anticoagulant is discussed according to the guidelines of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Scientific Standardization Committe, Subcommitte on Lupus Anticoagulants/Phospholipid-dependent Antibody. The guidelines include a four-step process of laboratory evaluation: 1. screening, 2. detection of inhibitor activity, 3. confirmatory tests, 4. ruling out other coagulopathies. Based on data in the literature and on our own experience an algorithm for the optimal and cost-effective diagnosis of lupus anticoagulant was established. Lupus anticoagulant sensitive APTT was used as screening test and in mixing studies to verify the presence of inhibitor. In the case the mixing of control plasma to the patient's plasma did not correct the prolonged APTT the mixing study was repeated after incubation of the mixture at 37°C for 1 hour. Following the verification of the presence of an inhibitor diluted prothrombin time was recommended as the first confirmatory test. In the case of negative results with diluted prothrombin time hexagonal phospholipid neutralization test was used as second confirmatory test. Ruling out other coagulopathies is recommended only in the case of dubious results. It was also demonstrated that the results of lupus anticoagulant and anti-cardiolipin antibody tests are not necessarily overlapping and both tests are required for the diagnosis of APS.
Key words: activated partial thromboplastin time, anti-cardiolipin antibody, anti-phospholipid antibody, anti-phospholipid syndrome, diluted prothrombin time, hexagonal phospholipid neutralization procedure, lupus anticoagulant, Russel Viper Venom time
Az antiphospholipid antitest syndroma (APS), mely lupus anticoagulans syndroma vagy Hughes syndroma néven is ismert, olyan autoimmun megbetegedés melyben a klinikai tünetek: thrombosis, vetélések és egyéb ide sorolt szülészeti rendellenességek hátterében az ún. anti-foszfolipid autoantitestek (APA) csoportjának van patogenetikai szerepe. A syndromát 1985-ben először - különálló entitásként - anticardiolipin syndromának nevezték el (1), majd később újranevezték APS-nek. (2) A megbetegedés elsődleges vagy primér APS, ha háttérbetegséggel nem rendelkező egyénben jön létre, és másodlagos vagy szekunder, amennyiben más autoimmun (leggyakrabban SLE) vagy tumoros megbetegedéshez társul. Az APA-k jelenléte klinikai tünetek nélkül nem patogén APA-nak minősül, és hátterében leggyakrabban gyógyszerhatás vagy infekció áll. Különösen a sokszor vírus infekcióhoz kapcsolódó gyermekkori lupus anticoaguláns tulajdonságú APA-kra igaz, hogy tranziens benignus jelenségnek tarthatók. (4)
1998-ban az International Consensus Workshop (3) definiálta az APS diagnózisának irányelveit. Eszerint meghatározott klinikai és laboratóriumi kritériumok egyidejű fennállására van szükség az APS diagnózis kimondásához. APS esetén az APA mindig vasculáris thrombosisok vagy terhesség körüli komplikációk kisérő jelensége. A thrombotikus epizód elég, ha egyszer fordul elő a laboratóriumi jelek fennállásának ideje alatt, és lehet artériás, vénás lokalizációjú vagy érintheti bármely szerv kisérhálózatát. Szülészeti komplikáció alapján APS akkor igazolható, ha legalább három olyan vetélés vagy legalább egy olyan tizedik gesztációs hét előtti magzat elhalás vagy 34. terhességi hét előtt történő koraszülés fordul elő az APA pozitivitás időszakában, amely szülészeti okokkal nem magyarázható.
Az APA jelenléte általában igen erősen asszociált a különböző thrombotikus klinikai történésekkel. Idiopathiás mély vénás thrombosis esetében a betegek 25%-ban, cerebrovasculáris thrombosis esetében a betegek 60 %-ban, TIA esetén 37%-ban, korai coronaria thrombosis esetén 18%-ban és ismétlődő vetélés esetén 60%-ban lehetett az APA jelenlétét kimutatni. (5) Hypoprothrombinaemia, súlyos thrombocytopenia, thrombocyta funkció zavar és uremia lupus anticoagulánssal egyidőben történő jelenléte esetén (4) azonban vérzékenység is lehet a klinikai tünet, amely elsősorban a bőr, a nyálkahártya és lágyrészek vérzésében nyilvánul meg.
Az APS laboratóriumi kritériuma a foszfolipid ellenes (helyesebben foszfolipid-függő) antitestek kimutatása. A már említett 1998-as nemzetközi konszenzus konferencia (3) állásfoglalása szerint az APS laboratóriumi diagnózisához a lupus antikoaguláns és/vagy az anti-kardiolipin (AKA) antitest kimutatása szükséges. Lupus antikoaguláns jelenléte akkor tekinthető diagnosztikusnak, ha annak kimutatása az International Society on Thrombosis and Haemsotasis, Scientific Standardization Committe, Subcommitte on Lupus Anticoagulants/Phospholipid-dependent Antibody irányelvei alapján történt és jelenléte a beteg plazmájában két vagy több alkalommal - legalább hat hetes időközökben - kimutatható. AKA esetében a közepes vagy magas titerben megjelenő IgG és/vagy IgM izotípusú antitestek (2 glikoprotein I (b 2 GPI) függő ELISA tesztben történő kimutatása jelent pozitivitást. Ez esetben is szükséges a legalább hat hetes időközben minimum kétszer mért pozitív eredmény. Esetenként IgA típusú AKA is megjelenhet anti-foszfolipid szindrómában.
A lupus antikoaguláns, illetve az AKA nem valódi foszfolipid-ellenes antitestek, az epitóp(ok), mely(ek) ellen az antitestek irányulnak bizonyos fehérjéken, leggyakrabban b 2 GPI-en, illetve protrombinon vannak (6-8). APS-ben ritkán előfordulnak valódi foszfolipid (kardiolipin, foszfatidil-szerin, foszfatidil-inozitol, foszfatidil-glicerol, illetve foszfatidil-etanolamin) ellenes antitestek is. Ezen antitestek fehérjék jelenléte nélkül is kötődnek az egyes foszfolipidekhez, de nem jelentenek sem fokozott thrombosis hajlamot, sem az APS egyéb klinikai tünetei szempontjából fokozott veszélyeztetettséget. Az úgynevezett AKA tehát nem kardiolipin ellen irányul, valójában nem is kötődik kardiolipinhez, hanem legtöbb eseteben b 2 GPI-ellenes antitestről van szó. A kardiolipinnel fedett ELISA lemezeken a hígító pufferben használt bovin szérumban lévő bovin b 2 GPI kötődik a kardiolipinhez és a reakcióban ez szolgál antigénként. A lupus antikoaguláns epitópja legtöbb esetben vagy b 2 GPI-en, vagy prothrombinon található (7, 8). A fenti foszfolipid-függő antitestek általában nem kötődnek a natív fehérjéhez (b 2 GPI-hez, vagy prothrombinhoz). Az antitest megkötésében résztvevő epitópok csak akkor kerülnek felszínre, esetleg csak akkor alakulnak ki, ha a fehérjék anionos foszfolipidekhez, vagy negatív töltésű felszínhez abszorbeálódnak.
Az ún. anti-foszfolipid (foszfolipid-függő) antitestek, tehát igen heterogének, s az alábbi variánsok különíthetők el:
Valódi foszfolipid-ellenes antitestek,
b 2 GPI-ellenes foszfolipid-függő antitestek (hagyományosan ezt hívjuk anti-kardiolipin antitestnek, AKA-nak) lupus antikoaguláns aktivitással vagy anélkül.
Prothrombin-ellenes foszfolipid-függő antitestek lupus antikoaguláns aktivitással (8, 9) vagy anélkül.
Egyéb koagulációs fehérjék (pl. nagy molekulasúlyú kininogén, protein C, protein S, komplement 4b-kötő fehérje, annexin V) ellen termelődött foszfolipid-függő autoantitestek (7, 10-13).
További heterogenitás forrása az egyes b 2 GPI-ellenes antitestek különböző fajspecificitása. Ezen antitestek általában nem mutatnak lényeges fajspecificitást és az AKA kimutatására szolgáló ELISA-kban használt bovin szérumban megtalálható bovin b 2 GPI-vel éppen úgy reagálnak, mint a humán b 2 GPI-vel. Kisebb részük azonban csak a humán b 2 GPI-vel reagál és emiatt nem ad pozitivitást az AKA ELISA-kban. Utóbbi antitestek humán antigént használó b 2 GPI ELISA-kban detektálhatók (7, 14). A b 2 GPI-ellenes antitestek e fehérje 5 "sushi" doménje közül az 1-sel és a 4-sel reagálnak. A lupus antikoaguláns hatással rendelkező b 2 GPI-ellenes antitestek elsősorban az aktivált X faktor által katalizált - foszfolipid-függő - protrombin-trombin átalakulást gátolják (15, 16).
A protrombin-ellenes foszfolipid-függő antitestek főleg a humán protrombinnal reagálnak (8). A reaktív epitóp(ok) a protrombinon, illetve a fragment 1+2-n találhatók (8, 17), a trombinnal nem mutatnak reakciót. A lupus antikoaguláns aktivitással bíró protrombin ellenes autoantitestek mind a X-es faktor aktivációját, mind a protrombin-trombin átalakulást gátolják a különböző in vitro, foszfolipid-függő tesztrendszerekben (8, 9, 18). Egyes antitestek igen nagy affinitással kötődnek a protrombinhoz, feltehetően ez magyarázza, hogy a lupus antikoaguláns esetek egy kis részében akár vérzékenységet is előidéző hypoprothrombinaemia észlelhető (19).
A lupus antikoaguláns tehát nem egy meghatározott foszfolipidhez kötött fehérje ellen irányul, hanem egy funkcionális entitás, melyet az alábbiak jellemeznek.
IgG, IgM vagy mindkét típusú olyan immunglobulin, mely interferál foszfolipid-függő alvadási tesztekkel.
Valamilyen foszfolipid-fehérje komplex ellen irányul, a reaktív epitóp a fehérjén (b 2 GPI, protrombin, esetleg egyéb fehérje) van.
In vitro antikoaguláns, in vivo fokozott veszélyeztetettséget jelenthet vénás és feltehetően artériás thrombosisra is.
A lupus antikoaguláns - korrekt diagnosztikai eljárásokkal - jól elkülöníthető egyéb keringő antikoagulánsoktól, így a specifikus alvadási faktorokat neutralizáló, illetve más nem specifikus, nem alvadási faktor ellen irányuló antikoagulánsoktól (pl. paraproteinek, FDP), továbbá a globális antikoaguláns hatással rendelkező heparin-szerű anyagoktól. Valójában a protrombin ellen irányuló lupus antikoaguláns besorolható lenne a specifikus alvadási faktor ellen irányuló, nem neutralizáló keringő antikoagulánsok közé is, a specifikus alvadási faktorok ellen irányuló többi nem neutralizáló antitesttől ezt a lupus antikoaguláns altípust a kötődés foszfolipid függése különbözteti meg.
A Nemzetközi Thrombosis és Haemostasis Társaság Tudományos és Standardizációs Bizottságán (International Society on Thrombosis and Haemostasis, Scientific and Standardization Committee) belül működő Lupus Antikoaguláns/Antifoszfolipid Antitestek Albizottság (Subcommettee on Lupus Anticoagulant/Antiphospholipid Antibodies) 1995-ben foglalta össze a lupus antikoaguláns laboratóriumi diagnosztikájára vonatkozó ajánlásait (20, 21). A diagnózis az alábbi négy egymást követő lépés során érhető el:
foszfolipid-függő alvadási teszt megnyúlása,
a foszfolipid-függő alvadási teszt megnyúlásáért felelős gátlótest keveréses vizsgálattal történő kimutatása,
annak demonstrálása, hogy a gátlótest foszfolipid-függő,
ha a diagnózis bizonytalan, egyéb a foszfolipid-függő alvadási teszt megnyúlásáért felelőssé tehető koagulopatiák (faktorhiány, alvadási faktor-ellenes inhibitorok stb.) kizárása.
A diagnózis felállítása tehát négy lépésből áll:
szűrés,
keveréses vizsgálatok,
megerősítő eljárások,
egyéb coagulopathiák kizárása.
Lupus antikoaguláns általában kétféle módon kerül diagnosztizálásra.
A laboratóriumba egyéb célból alvadási vizsgálatokra küldött minta esetében mellékleletként észlelünk megnyúlást egy foszfolipid-függő alvadási tesztben, rendszerint az aktivált parciális tromboplasztin időben (APTI-ben).
APS gyanúja esetében direkt lupus-antikoaguláns vagy anti-foszfolipid antitestek jelenlétére irányuló kivizsgálást kérnek a laboratóriumtól.
Utóbbi esetben különös gondot kell fordítani a minta előkészítésre. A thrombocyta-szegény plazma, melyből a legtöbb alvadási teszt készül, ugyanis még tartalmaz valamennyi (5-10 G/L) thrombocytát. Tekintettel arra, hogy a thrombocyták interferálnak a lupus antikoagulánssal, azaz relatíve kis számú thrombocyta jelenléte is csökkenti a szűrőtesztek lupus antikoaguláns iránti érzékenységét, szükség van az úgynevezett thrombocyta szegény plazmában lévő thrombocyták eltávolítására (22, 23). Ezt két úton érhetjük el:
Ismételt centrifugálást követően a plazma felső 2/3 részét leszívjuk, s ezt használjuk fel a vizsgálatokhoz. Ez az eljárás minimálisra csökkenti a thrombocyták jelenlétét.
A plazmának 0.22 um pólus nagyságú szűrőn történő filtrálásával. A filtráció spontán atmoszférikus nyomáson kell, hogy történjen, nyomás alkalmazása esetén ugyanis a thrombocyták tönkremennek, átpréselődhetnek a szűrőn, s a lizált thrombocyták jelentősen csökkentik a szűrőtesztek érzékenységét.
Fontos, hogy a kontroll plazmákat (melyeket a keveréses, illetve összehasonlító vizsgálatokhoz használunk) a beteg plazmájához teljesen hasonlóan kezeljük. További fontos szabály, hogy a thrombocyták eltávolítása előtt semmiképpen sem szabad a plazmát későbbi vizsgálatok céljára lefagyasztani, mert a fagyasztás, illetve az azt követő felolvasztás szintén thrombocyta lízist eredményez és a lizált thrombocyták már nem távolíthatók el a fenti eljárásokkal (21, 24).
Az alábbiakban a lupus antikoaguláns laboratóriumi diagnózisához vezető egyes lépéseket vesszük sorba, beiktatva saját vizsgálataink eredményeit, s konklúzióként egy, a tapasztalataink szerint hatékony algoritmust ajánlunk a lupus antikoaguláns szakszerű és ugyanakkor költséghatékony diagnosztizálására.
Elvileg valamennyi foszfolipid-függő alvadási tesztet használhatjuk a lupus antikoaguláns szűrőtesztjeként. E szűrőtesztek egy részét egyúttal a hemorrhagiás diathesisek szűrőtesztjeiként is használjuk, s tulajdonképpen az intrinzik út, az entrinzik út, illetve a közös út szűrőtesztjeinek felelnek meg. Az intrinzik utat magában foglaló, a lupus antikoaguláns diagnosztikájában használt szűrőtesztek az aktivált parciális tromboplasztin idő (APTI) és a kaolin alvadási idő (KAI). Utóbbi nem tartalmaz foszfolipidet, e tesztben a lupus antikoaguláns a vizsgált plazmában lévő kis mennyiségű foszfolipid ellen fejti ki hatását. Jóllehet több publikáció e tesztet tartja a lupus antikoaguláns legérzékenyebb szűrőtesztjének, saját több mint egy évtizedes tapasztalataink azt mutatják, hogy e teszt normál (referencia) tartománya a plazmában lévő alvadásaktív foszfolipid esetlegessége folytán igen széles, s nem szolgáltat a megnyúlás egzakt értékeléséhez megfelelő alapot. Tapasztalataink szerint egy a lupus antikoagulánsra érzékeny APTI a KAI-nál lényegesen megbízhatóbb szűrőteszt.
A különböző APTI reagensek lupus antikoaguláns érzékenysége rendkívül tág határok között változik. Ezért igen fontos a szűrőtesztként használt APTI reagens kiválasztásánál az irodalomban közölt lupus antikoagulánsra vonatkozó evaluációk ismerete (25-27). Íjabban a diagnosztikai piacon megjelentek ún. lupus antikoaguláns szenzitív APTI reagensek, mint pl. a Diagnostica Stago PTT-LA reagense. Hogy tapasztalatot szerezzünk e reagens és egy ugyanazon cég által gyártott lupus antikoaguláns érzékeny tradicionális APTI reagens (aPTT reagens, Diagnostica Stago) diagnosztikai hatékonyságáról 265 lupus antikoaguláns kivizsgálására érkezett plazma mintán összehasonítottuk a két tesztet (1. táblázat). Az 1. táblázat adataiból látszik, hogy a két teszt diagnosztikai hatékonysága között nincs lényeges különbség, 150 esetben (a lupus antikoaguláns pozitív esetek 94 %-ban) mindkét APTI reagenssel inkorrigábilis APTI megnyúlást mértünk, míg az esetek 5%-ban csak a lupus antikoaguláns szenzitív APTI, 1%-ában pedig csak a hagyományos APTI volt pozitív.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Az extrinzik út vizsgálatára szolgáló foszfolipid-függő alvadási teszt a protrombin idő (PI). A PI-nél használt tromboplasztin reagens azonban olyan sok foszfolipidet tartalmaz, hogy e teszt lupus antikoaguláns pozitivitás esetén csak abban az esetben nyúlik meg lényegesen, ha a lupus antikoaguláns titere igen magas, vagy affinitása igen nagy, illetve ha a lupus antikoagulánshoz hypoprothrombinaemia társul. Ezért a hagyományos PI nem használható a lupus antikoaguláns szűrőtesztjeként. Ha a PI-t erősen hígított tromboplasztinnal végezzük el (50-500-szoros hígítás), e teszt a lupus antikoaguláns érzékeny szűrőtesztje lehet. A hígított PI (hPI), illetve más néven hígított tromboplasztin idő érzékenysége az APTI-hez hasonlóan reagensfüggő, legérzékenyebbnek a rekombináns szöveti tromboplasztint használó reagensek bizonyultak (28). Jóllehet e teszt érzékenysége teljes mértékben megfelel a kívánalmaknak, a normál érték, illetve referencia tartomány megállapításának nehézsége miatt laboratóriumunkban nem konszideráljuk szűrőtesztként, azonban kiváló eredménnyel alkalmazzuk megerősítő tesztként.
A közös utat vizsgáló leggyakrabban használt szűrőteszt a Russel vipera méreg idő (RVMI), pontosabban ennek hígított foszfolipidet tartalmazó változata (hRVMI). A különböző cégek által forgalmazott hRVMI reagensek lupus antikoaguláns érzékenysége különböző, s esetenként még készülék (az alvadás detektáló mérési elvtől) függő is (29). E teszt diagnosztikai érzékenysége és specificitása szűrőtesztként nem múlja felül az APTI tesztekét, ezért laboratóriumunkban a lupus antikoaguláns szűrőtesztjeként APTI-t használunk. A lupus antikoaguláns "véletlen" felfedezése a hagyományos APTI reagenssel történik, míg a speciálisan lupus antikoaguláns kivizsgálásra érkezett minták esetében a lupusra érzékenyített PTT-LA-t használjuk. Mindkét esetben a kontroll értékhez viszonyítva több mint 8 sec-os megnyúlást tekintjük pozitívnak, s ez esetben tartjuk a továbbvizsgálást indokoltnak.
A véralvadás vizsgálatoknál bármiféle inhibitor kimutatása keveréses vizsgálatokkal történik. Ez esetben a megnyúlt alvadási idejű beteg plazmát meghatározott arányban kontroll plazmával keverjük. Inhibitor esetében a kontroll plazma nem tudja korrigálni az inhibitor által okozott megnyúlt alvadási időt. Faktor hiány esetén ezzel szemben a kontroll plazma hozzáadása közel normál értékre hozza vissza a beteg plazma megnyúlt alvadási idejét. APTI megnyúlás észlelése esetén a beteg:kontroll plazmák keverése történhet 1:1, illetve 4:1 arányában. A 4:1 arányban történő keverés túl sok fals pozitív eredményt ad, s megítélésünk, illetve az irodalmi adatok szerint (20) 4:1 arányú keveréssel az inhibitor és a faktor hiány kevésbé egyértelműen különíthető el.
Az APTI-vel történő keveréses vizsgálatok esetében akkor tekintjük a keveréken mért APTI eredményét inkorrigábilisnak, ha a normál keverő plazma APIT-jéhez viszonyítva több mint 5 sec-mal hosszabb APTI-t kapunk. A másik lehetőség az eredmény ún. Rosner indexben történő kifejezése (20, 30).
|
Rosner index = |
APTIkeverék - APTIkontroll |
x 100 |
|
APTIbeteg |
Az eredményt akkor tekintjük inhibitorra pozitívnak, ha a Rosner index nagyobb mint 15.
Az inhibitor jelenlétét detektálhatjuk hRVMI segítségével is. Ebben az esetben a keverék és a kontroll plazma hRVMI-jének az arányát számítjuk ki. Az 1,2-et meghaladó arány inhibitor jelenlétét bizonyítja.
A klasszikus lupus antikoaguláns ún. azonnal ható inhibitor, azaz a kontroll és a beteg plazma szobahőn történő összemérését követően azonnal hat és az így készült keverékben inkorrigábilis alvadási időt mérünk. Kimutatták azonban, hogy létezik progresszív inhibitor sajátosságokkal rendelkező lupus antikoaguláns is (21, 31, 32), s egyes tanulmányok szerint az ilyen lupus antikoaguláns teszi ki az esetek közel 30 %-át. Ezért ha a szobahőn történő összekeverést azonnal követő vizsgálat negatív eredményt hoz, a keveréket (és természetesen a kontroll plazmát is) 37 °C-on egy óráig történő inkubálást követően újra le kell mérni, s a korrigábilitást a fentiekben elmondottak szerint újra értékelni. A gyenge, progresszív inhibitorokat csak ilyen módon lehet megbízhatóan detektálni.
Elvileg - és gyakorlatilag is - a gátló hatás foszfolipid-függésének kimutatása két módon történhet.
A foszfolipid koncentráció hígításával a gátló hatás fokozódik.
A foszfolipid koncentráció növelésével a gátló hatás csökken vagy megszűnik.
Az előző elven alapuló tesztek közé tartozik az APTI hígított foszfolipiddel történő elvégzése, illetve a már említett hPI. A hPI esetében tömény foszfolipiddel közel azonos protrombin időt adó kontroll és beteg plazmákat hasonlítunk össze, végkoncentrációban 50-szeres és 500-szoros tromboplasztin hígítással kivitelezett PI tesztben. Ha a beteg tömény tromboplasztinnal meghatározott PI-je több mint egy secundummal hosszabb a kontroll PI-jénél, úgy a kontroll plazmát fiziológiás nátrium kloriddal olyan mértékben hígítjuk, hogy protrombin ideje ne térjen el több mint egy secundummal a beteg plazma PI-jétől. Ezt követően a hígított tromboplasztinnal mind a beteg plazmán, mind a kontroll plazmán, illetve az utóbbi megfelelő mértékű hígításán elvégezzük a PI meghatározást. Ha a beteg és kontroll plazma PI jének aránya valamelyik hígításnál meghaladja az 1,2-et, a mintát lupus antikoaguláns pozitívnak tekintjük. A legtöbb kereskedelemben kapható foszfolipid a citrátos plazma rekalcifikáláshoz szükséges kalciumot is tartalmazza. A tromboplasztin hígításakor a kalcium koncentráció 50-500-szor kevesebb lesz, azaz nem elegendő a rekalcifikációhoz. Ezért ez esetben a plazma és a tromboplasztin hígítás összemérését követően a tesztet CaCl2 (általában 20 mmol/L) hozzáadásával indítjuk.
Az emelt foszfolipid mennyiséget használó tesztek közül az alábbiak a legelterjedtebbek:
RVMI megerősítő teszt,
thrombocyta neutralizációs teszt (TNT) (21, 23),
hexagonális foszfolipid neutralizációs teszt (33).
A RVMI esetében a megerősítő teszt a szűrőtesztnél lényegesen töményebb foszfolipidet használ. Ez esetben a beteg plazmán híg foszfolipiddel mért RVMI és az ugyanezen plazmán töményebb foszfolipiddel mért RVMI arányát számoljuk, s ha ez az arány - a laboratóriumunkban használt American Diagnostica által forgalmazott kit esetében - meghaladja az 1,2-et a plazma lupus antikoaguláns pozitívnak tekinthető.
A thrombocyta neutralizációs tesztben friss vagy konzervált thrombocyta lizátumot adunk az alkalmazott teszthez (pl. APTI-hez) és az alvadási idő rövidülésének mértéke utalhat lupus antikoaguláns jelenlétére. Tekintettel arra, hogy a thrombocyták heparint antagonizáló thrombocyta 4-es faktort is tartalmaznak, e teszt heparin jelenlétében fals pozitív eredményt adhat (21).
A hexagonális foszfolipid neutralizációs teszt Rauch és mtsai azon megfigyelésén alapszik, hogy a hexagonális fázisú foszfolipidek neutralizálják a lupus antikoaguláns aktivitását (34, 35). A Diagnostica Stago StaClot LA néven forgalomba hozott egy hexagonális foszfolipid neutralizációs tesztet, melyben tojás foszfatidil-etanolamint használnak hexagonál (II) fázisú foszfolipidként. A teszt az evaluáció során lupus antikoaguláns specifikusnak bizonyult (33).
Laboratóriumunkban a megerősítő tesztkombináció optimális kialakítása érdekében az alábbi három megerősítő tesztet vizsgáltuk: az American Diagnostica RVMI megerősítő tesztjét (dRVVT confirm), a hPI-t, melyben hígított humán rekombináns tromboplasztint (Innovin, Dade Behring) használtunk, és a hexagonális foszfolipid tesztet (StaClot LA, Diagnostica Stago). Az RVMI megerősítő teszt és a hPI diagnosztikai hatékonyságának összehasonlítását a 2. táblázat mutatja. Az RVMI megerősítő tesztje a megnyúlt, normál plazmával nem korrigálható APTI-jű betegek csak 27 %-ban bizonyított lupus antikoagulánst. A hPI ezzel szemben e betegcsoport 47 %-ában mutatott ki lupus antikoagulánst. A hPI lupus antikoaguláns érzékenysége tehát lényegesen meghaladja az RVMI alapú teszt érzékenységét. Ha a hPI mellet még az RVMI megerősítő tesztet is elvégeznénk, az csak 8 %-kal (55 %-ra) emelné a kimutatott esetek számát. Tekintettel arra, hogy a hPI lényegesen olcsóbb is mint az RVMI, elsődleges megerősítő tesztként a hPI-t ajánljuk. A megnyúlt, nem korrigálható APTI hátterében kevésnek tartottuk a 47 % lupus antikoagulánst, s ezért szükségesnek látszott egy második megerősítő teszt alkalmazása a hPI-vel kapott negatív esetek vizsgálatára.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
A 3. táblázat a hexagonális foszfolipid teszt hatékonyságát mutatja az RVMI-vel, hPI-vel, illetve mindkét teszttel negatív esetekben. Az eredmények azt mutatják, hogy a negatív esetek kb. 60 %-a a hexagonális foszfolipid neutralizációs teszttel lupus antikoagulánsnak diagnosztizálható. Ez esetünkben azt jelenti, hogy a hPI-vel pozitív, és a hPI-vel negatív de a hexagonális foszfolipid neutralizációs teszttel pozitív esetek aránya kb. a megnyúlt inkorrigábilis APTI-t mutató esetek 80%-a.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Amennyiben a diagnózis kétséges, szükség lehet az alvadási faktor deficienciák, illetve egyéb, az alvadási teszteket gátló anyagok jelenlétének a kizárása. Az öröklött alvadási faktor hiány egy meghatározott alvadási faktor izoláltan csökkent faktor szintjével verifikálható. Fontos azt tudni, hogy a lupus antikoaguláns interferálhat az előfázis faktorainak (VIII, IX, XI, XII faktorok) egyfázisú APTI alapú meghatározásával. Ez esetben azonban a faktor szint csökkenés rendszerint több alvadási faktort is érint és a plazma hígítás növelésével emelkednek a mért faktor szintek. Kombinált faktor szint csökkenés kongenitálisan a V és VIII faktor igen ritka együttes deficienciája, illetve a szerzett faktorhiányok közül a K-vitamin hiány, vagy a K-vitamin antagonista okozta protrombin VII, IX, X-es faktor szint csökkenés továbbá a faktor szintek consumptios coagulopathiákban bekövetkező csökkenése. E kombinált faktorszint csökkenések azonban megfelelő laboratóriumi vizsgálatokkal könnyen diagnosztizálhatók.
A gátló hatású anyagok közül a faktor ellenes neutralizációs autoantitestek, illetve a heparin jön elsősorban szóba, mint differenciál diagnosztikai probléma. A faktor ellenes antitestek általában egy alvadási faktor igen alacsony aktivitását eredményezik és nem mutatnak foszfolipid-függést. A heparin hatás a trombin idő heparin antagonista nélkül és heparin antagonista jelenlétében történő elvégzésével, vagy Hepzym teszttel könnyen kimutatható.
A fenti eredmények és az irodalmi adatok alapján állítottuk össze az 1. ábrán mutatott algoritmust. Szűrőtesztként az APTI-t, illetve ha speciálisan lupus antikoaguláns irányú kivizsgálást kérnek a lupus antikoaguláns szenzitív APTI-t használjuk. APTI megnyúlás esetén keveréses vizsgálatot végzünk. Ha a normál plazma korrigál, akkor 37°C-on egy óráig tartó inkubáció után is meghatározzuk a keverék APTI-jét. Ha a normál plazma nem korrigál, ill. a korrekció a 37°C-on egy óráig tartó inkubáció során megszűnik, első megerősítő tesztként hPI-t végzünk, s ennek pozitivitása biztosítja a diagnozist. Csak hPI negatív esetekben, második megerősítő tesztként végezzük el az igen költséges, de legérzékenyebbnek tűnő hexagonális foszfolipid neutralizációs tesztet. Ennek pozitivitása esetén is lupus antikoaguláns a diagnózis.
1. ábra
Algoritmus a lupus antikoaguláns kivizsgálására.
A felső négyszögben vonallal elválasztott két lehetőség közül a felső a beérkezett mintákból "véletlenül" detektált APTI megnyúlásokra, az alsó a speciálisan lupus antikoaguláns kivizsgálásra érkezett mintákra vonatkozik.
APTI: aktivált parcialis tromboplasztin idő, FL: foszfolipid, hPI: hígított protrombin idő, LA: lupus antikoaguláns, PTT-LA: a Diagnostica Stago lupus antikoaguláns érzékeny APTT reagense
A különböző immunoassay-kkel kimutatható foszfolipid ellenes (foszfolipid függő) antitestek részletes tárgyalása nem célja ezen összefoglalónak. Már említettük, hogy az ún. antikardiolipin antitestek (AKA) kimutatása esetében az ELISA lemezre kardiolipint kötünk, s az ehhez kötődő b2-glikoprotein I szolgáltatja az antigén-antitest reakcióban résztvevő epitópot. Az AKA kimutatására szolgáló, a kereskedelemben kapható kitekben a valamennyi izotípusú antitest kimutatására szolgáló szűrőteszt mellett IgG, IgM, IgA izotípusú AKA kimutatására is van lehetőség. Szintén kaphatók az ún. antifoszfatidil-szerin antitestek (APSA) kimutatására szolgáló ELISA tesztek. Ez esetben az ELISA lemez fedése foszfatidil-szerinnel történik, a reaktív epitóp itt is plazmafehérjén található. Dirket b2-glikoprotein I ellenes antitestek szűrővizsgálatára és izotípus szerinti kimutatására is van lehetőség. Ez esetben a g sugárral besugározott, PVC-ből készült, vagy foszfatidil-szerinnel fedett ELISA lemezhez b2-glikoprotein I-t kötnek. Tudomásunk szerint hasonló módon készült, protrombin ellenes antitest kimutatására szolgáló ELISA kit még nincs forgalomban, de rövidesen kapható lesz. Addig is - ahol erre igény van - a protrombin ellenes antitestek házilag készült ELISA kitek segítségével kimutathatók.
Már említettük, hogy a b2-glikoprotein I, illetve protrombin ellenes antitest egy része rendelkezik lupus antikoaguláns aktivitással más része azonban nem. Laboratóriumunkban ennek kiegészítéseként azt vizsgáltuk, hogy lupus antikoaguláns pozitív esetben kimutatható-e anti-kardiolipin antitest. Az 4. táblázat e vizsgálatok egy részét mutatja. Világosan látszik, hogy a vizsgált 10 lupus antikoaguláns pozitív beteg közül 3-ban nem mutatható ki AKA pozitivitás. Az irodalmi adatok és saját vizsgálataink is arra utalnak, hogy az APS diagnosztikájában a lupus antikoaguláns, illetve a foszfolipid függő antitestek ELISA-val történő kimutatása nem helyettesíti egymást, a kettőt egymás mellett egymás kiegészítéseként kell végezni. Arra vonatkozóan még nincs egyértelmű válasz, hogy a b2-glikoprotein I ellenes antitest kimutatása teljes mértékben kiváltja-e az AKA teszteket, illetve, hogy e tesztek mellé a rutindiagnosztikai vizsgálati profilba be kell-e venni a protrombin ellenes antitest kimutatását is.
|
4. táblázat Antikardiolipin antitest (AKA) pozitivitás lupus antikoagulánst tartalmazó mintáknál
Diagnosztikai szempontból értékelhető AKA pozitivitást a ++ és +++ erősségű reakció jelent. |
A foszfolipid-függő antitestek esetében a kiteket gyártó cégek ma már legtöbbször rendelkezésre bocsátják a belső minőségellenőrzéshez szükséges kontroll savókat is. Lupus antikoaguláns esetében a belső minőségellenőrzésnek ez a fajtája még nem megoldott, de rövidesen várható az előrelépés. Igen komoly előrelépés viszont, hogy a lupus antikoaguláns kimutatása ma már benne van a European Concerted Action on Thrombosis and Disabilities (ECAT) külső minőségellenőrzési profiljában. Laboratóriumunk 3 éve vesz részt az ECAT minőségellenőrzési vizsgálataiban, s a minőségellenőrzés szakszerűsége, megbízhatósága, rendszeressége miatt a részvétel minden lupus antikoaguláns és általában thrombophilia diagnosztikát végző laboratórium számára ajánlott.
Jelenleg több meglehetősen különböző elmélet létezik arra, hogy a lupus antikoaguláns miért okoz thrombophiliát. A lehetséges koncepciók egyike, hogy a lupus anticoaguláns tulajdonságú antitestek szöveti faktor expressziót indukálnak az endothel sejtekben, amit "in vitro" humán köldökzsinór endothel monolayer-en végzett kísérletek valószínűsítenek (36).
A foszfolipid függő antitrombotikus mechanizmusok szelektív blokkolása a véralvadás egyensúlyának thrombotikus irányba való eltolódása több elmélet alapjául is szolgál. Az egyik ilyen elmélet a prosztaciklin képzés és felszabadulás gátlását teszi felelőssé a thrombosis hajlam kialakulásáért. A prosztaciklin foszfolipidekből lehasadó arachidonsavból alakul ki, ha az arachidonsav előalakjául szolgáló foszfolipidek a foszfolipidekhez kötődő antitestek okozta gátlás miatt a prosztaciklin szintézis számára hozzáférhetetlenek, úgy a prosztaciklin képzés és felszabadulás is gátolttá válik (37).
További lehetséges ilyen mechanizmusok az endothel sejt felszínén lévő heparán szulfát antitrombin-III-mal való kapcsolódásának gátlása, vagy az aktivált protein C (APC)-protein S (PS) komplex foszfolipid felszínhez történő szelektív gátlása (39, 40). Megfelelő kísérleti eredmények nélkül nehezen volt értelmezhető, hogy bár a véralvadás valamennyi komplexe membrán felszínhez kötött ? aktivátor, inaktivátor, és inhibitor komplexek egyaránt ? in vivo miért csak az inaktivátorok/inhibitorok kialakulása vagy működése akadályozott az APA-k által. Az APC-PS rendszer gátlási elmélet igazolására létrehozott kísérletes modell azonban érdekes feloldását adta annak, hogy egyszerű immunglobulinok hogyan lehetnek különböző hatással egyes véralvadási faktorok, ill. inhibitorok thrombocyta felszínhez történő bekötődésre. Eszerint a véralvadási komplexekben levő különböző fehérjék más-más foszfolipid összetételű membránhoz mutatnak megfelelő kötődést és következményesen megfelelő aktiválódást. Az APC membránhoz való kötődése pl. kifejezett foszfatidiletanolamin (PE) függést mutat. PE hiányában az APC kötődése és aktivitása minimális. Ugyanakkor a protrombináz komplex enzimének membránhoz való kötődése független a PE jelenlététől. (41) Ismertek olyan APS diagnózisú esetek (42), melyek során izolált APA-k kizárólag a PE-al reagáltak. Ezekben az esetekben a protrombináz komplex működése zavartalan, az APC-PS komplex működése pedig szelektíven gátolt.
Az utóbbi évek irodalmában egyre nagyobb hangsúlyt kapott két egészen új szemléletű elmélet a lupus anticoagulans hatásmechanizmusának értelmezésére. A Vermylen és mtsai által megalkotott teória (43) szerint az APS egyes IgG2 izotípusú APA-t tartalmazó változataiban, antitest mediált thrombocyta aktiváció áll a következményes thrombosis hátterében. A thrombocyta felszíni FcgRIIa receptor nagy affinitással kötheti a komplexben lévő IgG2 Fc részét. A receptorhoz való kötődés direkt sejtszignál mechanizmusokon keresztül thrombocyta aktivációhoz vezet. Az APA-k egyrészt az aktivált thrombocyta membrán negatív töltésű foszfolipidjeihez kapcsolódó b2-glikoprotein I (vagy más foszfolipid kötő fehérje) felszínre kerülő epitópjához epitópjaihoz kötődnek. Másrészt az így komplexbe került antitest Fc része nagy affinitással kapcsolódik az FcgRIIa receptorhoz, és thrombocyta aktivációt okoz.
Az Annexin-V antitrombotikus védőréteg APA-mediált sérülése, vagy más néven annexin-V hipotézis Rand JH és mtsai által 1999-ben került közlésre (45). Az annexin-V (placenta eredetű antikoaguláns protein I, vagy vaszkuláris antikoaguláns alfa) igen nagy affinitással kötődik az anionos foszfolipid felszínhez és így "in vitro" potens antikoaguláns (46). "In vivo" a trofoblastok és az érendothel apikális, vérkeringéssel közvetlenül kapcsolatban levő felszínén réteget képez. Ez a védő réteg APS szindrómában immunhisztokémiai módszerekkel kimutathatóan lényegesen csökken (45). Az annexin-V nem celluláris foszfolipid felszínhez történő bekötődésének APA okozta csökkenése kísérleti rendszerben is igazolásra került (46). A teória szerint, lupus antikoaguláns esetén az annexin-V és az APA-k versengenek a negatív töltésű foszfolipid felszínhez való kapcsolódásért, aminek eredménye az annexin-V antitrombotikus védőréteg sérülése. A "lefedetlen", prokoaguláns komplexek kialakulásához negatív töltésű foszfolipid felszínt biztosító membránrészek érintkezésbe kerülnek a keringő vérárammal, elősegítve ezzel a prokoaguláns véralvadási folyamatokat.
Hughes GR. The anticardiolipin syndrome
Clin Exp Rheumatol 1985; 3:285-286.
Harris EN, Hughes GRV, Ghavari AE. The antiphospholipid antibody syndrome J Reumatol 1987; Suppl 13: 210.
Wilson WA, Gharavi AE, Koike T, et al.: International consensus statement on preliminary classification criteria for definite antiphospholipid syndrome: report of an international workshop
Arthritis Rheum 1999; 42: 1309-1311.
Manco-Johnson MJ. Antiphospholipid antibodies in children Seminars in thrombosis and hemostasis 1998; 24: 591-598.
Bick RL, Arun B, Frenkel E P. Antiphospholipid-thrombosis syndromes
Haemostasis 1999; 29: 100-110.
Roubey RAS. Immunology of the antiphospholipid antibody syndrome
Arthritis Rheum 1996; 39: 1444-54.
Roubey RAS. Immunology of the antiphospholipid syndrome: antibodies, antigens, and autoimmune response Thromb Haemat 1999; 82:: 656-61.
Galli M, Barbui T. Antiprothrombin antibodies: Detection and clinical significance in the antiphospholipid syndrome
Blood 1999; 93: 2149-57.
Bevers EM, Galli M, Barbui T, et al.: Lupus anticoagulant IgG's (LA) are not directed to phospholipids only, but to a complex of lipid-bound human prothrombin
Thromb Haemat 1991; 66: 629-632.
Sugi T, McIntyre JA. Autoantibodies to phosphatidylethanol-amine (PE) recognize a kininogen-PE complex
Blood 1995; 86: 3083-9.
Matsuda J, Saitoh N, Goihci K. Anti-annexin V antibody in systemic lupus erythematosus patients with lupus anticoagulant and/or anticardiolipin antibody
Am J Hematol 1994; 47: 56-58.
Oosting JD, Derksen RHWM, Bobbink IWG, et al.: Antiphospholipid antibodies directed against a combination of phospholipid with prothrombin, protein C or protein S: an explanation for their pathogenetic mechanism?
Blood 1993; 81: 2618-2625.
Pengo V, Biasiolo A, Brocco T, et al.: Autoantibodies to phospholipid-binding plasma proteins in patients with thrombosis and phospholipid-reactive antibodies
Thromb Haemost 1996; 75: 721-724.
Arvieux J, Darnige L, Hachulla E, et al.: Species specificity on anti-(2-glycoprotein I autoantibodies and its relevance to anticardiolipin antibody quantitation
Thromb Haemat 1996; 75: 725-30.
Galli M, Finazzi G, Bevers EM, et al.: Kaolin clotting time and dilute Russell's viper venom time distinguish between prothrombin- and b2-glycoprotein I-dependent antiphospholipid antibodies
Blood 1995; 86: 617-623.
Shi W, Chong BH, Hogg PJ, et al.: Anticardiolipin antibodies block the inhibition by b2-glycoprotein I of the factor Xa generating activity of platelets
Thromb Haemat 1993; 70: 342-345.
Rao VM, Hoang AD, Rapaport SI. Mechanism and effects of the binding of lupus anticoagulant IgG and prothrombin to surface phospholipid
Blood 1996; 88: 4173-82.
Permpikul P, Rao LVM, Rapaport SI. Functional and binding studies of the roles of prothrombin and b2-glycoprotein I in the expression of lupus anticoagulant activity
Blood 1994; 83: 2878-92.
Bajaj SP, Rapaport SI, Fierer DS, et al.: A mechanism for the hypoprothrombinemia of the acquired hypoprothrombinemia-lupus anticoagulant syndrome
Blood 1983; 61: 684-92.
Brandt JT, Barna LK, Triplett DA. Laboratory identification of lupus anticoagulants: results of the second international workshop for identification of lupus anticoagulants. On behalf of the subcommittee on lupus anticoagulants/ antiphospholipid antibodies of the ISTH
Thromb Haemost 1995; 74: 1597-1603.
Triplett DA. Lupus anticoagulant. In: Laboratory techniques in thrombosis a manual. 2nd revised edition of ECAT assay procedures. Jespersen J, Bertina RM, Haverkate F (eds) Kluwer Academic Publishers, Dordrecht 1999; 183-187.
Sletnes K, Graven K, Wisloff F. Preparation of plasma for the detection of lupus anticoagulants and antiphospholipid antibodies
Thromb Res 1992; 66: 43-53.
Brandt JT, Triplett DA, Alving B, Scharrer I. Criteria for the diagnosis of lupus anticoagulants: an update
Thromb Haemost 1996; 74: 1185-90.
Kaczor DA, Bickford NM, Triplett DA. Evaluation of different mixing study reagents and dilution effect in lupus anticoagulant testing
Am J Clin Pathol 1991; 95: 408-11.
Denis-Magdelaine A., Flahault A, Verdy E. Sensitivity of sixteen APTT reagents for the presence of lupus anticoagulants
Thromb Haemost 1995; 25: 98-105.
Goudemand J, Caron C, De Prost D, et al.: Evaluation of sensitivity and specificity of a standardized procedure using different reagents for the detection of lupus anticoagulants. The Working Group on Hemostasis of the Societe Francaise de Biologie Clinique and for the Groupe d'Etudes sur I'Hemostase et la Thrombose
Thromb Haemost 1997; 77: 336-42.
Arnout J, Meijer P, Vermylen J. Lupus anticoagulant testing in Europe: an analysis of results from the first European Concerted Action on Thrombophilia (ECAT) survey using plasmas spiked with monoclonal antibodies against human beta2-glycoprotein I
Thromb Haemost 1999; 81: 929-34.
Arnout J, Vanrusslet M, Huybrechts E, et al.: Optimization of the dilute prothrombin time for the detection of the lupus anticoagulant by use fo a recombinant tissue thromboplastin
Br J Haematol 1994; 87: 94-9.
Lawrie AS, Mackie IJ, Pury G, et al.: The sensitivity and specificity of commercial reagents for the detection of lupus anticoagulant show marked differences in performance between photo-optical and mechanical coagulometers
Thromb Haemost 1999; 81: 758-62.
Rosner E, Pauzner R, Lusky A, et al.: Detection and quantitative evaluation of lupus circulating anticoagulant activity
Thromb Haemost 1987; 57: 144-7.
Triplett DA, Brandt JT, Maas RL. The laboratory heterogenity of lupus anticoagulants
Arch Pathol Lab Med 1985; 109: 946-51.
Clyne LP, White PF. Time dependency of lupus-like anticoagulants
Arch Intern Med 1988; 148: 1060-3.
Triplet DA, Barna LK, Unger GA. A hexagonal (II) phase phospholipid neutralization assay for lupus anticoagulant identification
Thromb Haemost 1993; 70: 787-93.
Rauch J, Tannenbaum M, Tannenbaum H, et al.: Human hybridoma lupus anticoagulants distinguish between lamellar and hexagonal phase lipid systems
J Biol Chem 1986; 261: 9672-7.
Rauch J, Tannenbaum M, Janoff AS. Distinguishing plasma lupus anticoagulants from anti-factor antibodies using Hexagonal (II) phase phospholipids
Thromb Haemost 1989; 62: 892-6.
Branch DW, Rodgers GM. Induction of endothelial cell tissue factor activity by sera from patients with antiphospholipid syndrome: A possible mechanism of thrombosis
Am J Obstet Gynecol 1993; 168: 206-210.
Carreras LO, Defreyn G, Machin SJ, et al.: Arterial thrombosis, intrauterine death and "lupus" anticoagulant: detection of immunglobulin interfering with prostacyclin formation
Lancet 1981; I: 244-246.
Field SL, Brighton TA, McNeil HP, et al.: Recent insights into antiphospholipid antibody-mediated thrombosis
Baillieres Best Pract Res clin Haematol 1999; 12: 407-422.
Esmon NL, Smirnov MD, Esmon CT. Lupus anticoagulants and thrombosis: the role of phospholipids
Haematologica 1997; 82: 474-477.
Roubey RAS. Autoantibodies to phospholipid-binding plasma proteins: A new view of lupus anticoagulants and other "antiphospholipid" autoantibodies
Blood 1994; 84: 2854-2867.
Esmon NL, Smirnov MD, Esmon CT. Thrombogenic mechanisms of antiphospholipid antibodies
Thromb haemost 1997; 78: 79-82.
Berard M, Chantome R, Marcelli A, Boffa M-C. Antiphosphatidylethanolamine antibodies as the only antiphospholipid antibodies. I. Association with thrombosis and vascular cutaneous diseases
J. Reumatol 1996; 23: 1369-1374.
Vermylen J, Hoylaerts MF, Arnout J. Antibody-mediated thrombosis
Thromb Haemost 1997; 78: 420-426.
Warmerdam PAM, van de Winkel JGJ, Vlug A, Westerdaal NAC, Capel PJA. A single amino acid in the second Ig-like domain of the Fcg receptor II is critical for human IgG2 binding
J immunol 1991; 147: 1338-1343.
Rand JH, Wu XX. Antibody-mediated disruption of the annexin-V antithrombotic shield: A new mechanism for thrombosis in the antiphospholipid syndrome Thromb Haemost 1999; 82: 649-655.
Rand JH, Wu XX, Andree HA, Ross JB, Rusinova E, Gascon-Lema MG, Calandri C, Harpel PC. Antiphospholipid antibodies accelerate plasma coagulation by inhibiting annexin-V binding to phospholipids: a "lupus procoagulant" phenomenon
Blood 1998; 92: 1652-1660.
* Levélcím: dr. Ajzner Éva
Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum,
Klinikai Biokémiai és Molekuláris Patológiai Intézet,
H-4012 Debrecen Pf. 40
E-mail: ajzner@jaguar.dote.hu
Fax: 52/417-631, Tel.: 52/431-956